ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЮГЛОНА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ОКОЛОПЛОДНИКА JUGLANS NIGRA L.

ТУШКАНОВА О.В.1, БОЙКО И.Е.1
1 ФГБОУ ВО «Майкопский государственный технологический университет»

В статье представлены результаты экспериментов по выделению юглона из околоплодника ореха черного (Juglans nigra L.) и изучению его антибиотической активности в отношении штаммов Staphуlococcus aureus и Escherichia coli как наиболее характерных представителей грамположительных и грамотрицательных бактерий.

ВВЕДЕНИЕ
Юглон
(5-гидрокси-1,4-нафто-
хинон) и его производные – природ-
ные соединения из группы нафтохи-
нонов, содержащиеся в разных частях
растений рода ореха Juglans L., обла-
дают широким спектром биологичес-
кого действия, включая антибиотическое, фи-
тотоксическое, инсектицидное, фунгицидное и
др. [2]. Хиноидная структура широко распростра-
нена в природе. Согласно данным из природных
источников выделено около 1500 соединений с
хиноидным ядром [6]. Хиноны являются важным
классом природных и синтетических соедине-
ний с большим разнообразием функций. Хоро-
шо известна их роль в биохимии живых клеток.
Есть данные о том, что юглон угнетает активность
такого
фермента,
как
фосфатидилинозитол-3-
киназа, с чем связывают его антиканцерогенные
свойства, при этом не отмечается токсичность,
свойственная другим цитостатикам [5]. Юглон по-
лучают в основном из различных частей грецкого
ореха (чаще из околоплодника). Однако исполь-
зовать грецкий орех, являющийся ценным пище-
вым растением, в качестве сырья для получения
юглона нерационально. Поэтому изыскание но-
вых источников получения юглона является ак-
туальной задачей. Например, части ореха черно-
го (Juglans nigra L.) также содержат юглон, причем
в количествах, превышающих его содержание в
грецком орехе [1]. Черный орех является широ-
ко распространенным растением, применяется в
технических целях для лесозащитных полос, как
источник ценной древесины и др. Плоды черного
ореха не используются как пищевой продукт. По-
этому выделение юглона из частей черного оре-
ха (околоплодника, плодов, цветков) экономи-
чески более целесообразно.
Многие хиноны, например 5-гидрокси-1,4-
нафтохинон (юглон) и его 2-метилгомолог плюм-
багин, выделенные из различных высших рас-
тений, ингибируют рост бактерий и грибов и
используются растениями как защитные вещест-
ва [2]. Хиноидное ядро входит в структуру раз-
личных, практически важных противоопухоле-
вых препаратов (антрациклиновых цитостати-
ков и гетероциклических хинонов). К настоящему
времени принято считать, что цитотоксический
эффект хинонов обусловлен: а) их способностью
продуцировать
кислородсодержащие
ные радикалы, б) электрофильностью хиноидно-
го ядра, легко образующего аддукты с различны-
ми бионуклеофилами [6].
Целью данной работы явилось выделе-
ние юглона из околоплодника ореха черного и
подтверждение его антибиотической активнос-
ти в отношении штаммов Staphуlococcus aureus и
Escherichia coli.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования
Тест-объекты – музейные типичные представите-
ли (Г+) и (Г–) бактерий – Staphуlococcus aureus (стафило-
кокк золотистый) и Escherichia coli (кишечная палочка).
Реактивы:
•
Стандарт
Sigma-Aldrich
(5-гидрокси-1,4-нафтохи-
нон – юглон 97%, стандартный образец, № 481-39-0,
производитель Acros).
•
Диметилкетон (ацетон, 1 л, ч.д.а., ГОСТ 2603-79).
•
Этоксиэтан (эфир диэтиловый, х.ч.,
ТУ 2600-001-45682126-13).
•
Железа (III) хлорид, раствор с массовой долей 10%
(ГОСТ 4517-87).
•
Кислота хлористоводородная 8,3% (ГОСТ 4517-87).
•
Натрия сульфат безводный, массовая доля сер-
нокислого натрия Na SO (%) – не менее 99,5%,
2
4
ГОСТ 4166-76).
•
Гидроксид калия (КОН), раствор с массовой долей
10% (ГОСТ 4517-87).
•
Приготовление реактива Драгендорфа строго по
ГФ ХI, Т. 2, С. 125 Поставщик: ЗАО «Вектон», Санкт-
Петербург. Химреактивы и техническая химия.

Лабораторная посуда и оборудование
•
Химическая посуда: флаконы, воронки, делитель-
ные воронки, мерные пипетки, химические стака-
ны, чашки Петри.
•
Наборы для тонкослойной хроматографии (плас-
тинки марки Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ, ТУ 26-11-17-89,
Краснодар, Россия).
•
Спектрофотометр СФ-2000, соответствует требо-
ваниям ГОСТ 15150-69, ЗАО «ОКБ Спектр», Санкт-
Петербург, Россия.
•
Инкубатор/термостат микробиологический BD 240
BINDER (Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение
фитоэкстракта
из
околоплодника
ореха черного (Juglans nigra L.) проводили по ранее
предложенной методике [3]. Выделение юглона про-
водили по разработанной нами методике: 5,0 г (точ-
ная навеска) помещали в коническую колбу вмести-
мостью 250 мл, прибавляли 100 мл воды, 10 мл 10%
водного раствора железа (III) хлорида, 40 мл кисло-
ты хлористоводородной 8,3%, перемешивали, нагре-
вали на водяной бане с обратным холодильником в
течение 1 ч. Смесь охлаждали, количественно пере-
носили в делительную воронку вместимостью 250 мл
и проводили экстракцию хлороформом дважды по
40 мл в течение 2 мин. Хлороформную фазу отделяли,
фильтровали через бумажный фильтр с 2 г безводно-
го натрия сульфата, и полученный фильтрат упари-
вали при температуре 40 °С досуха. К сухому остат-
ку добавляли 10 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия,
тщательно перемешивали и фильтровали. Фильтрат
(рН 11-12) экстрагировали равной порцией диэтило-
вого эфира, водную фазу отделяли, подкисляли раст-
вором хлористоводородной кислоты до рН 2-3 и про-
водили
экстракцию
хлороформом.
Органическую
фазу отделяли, фильтровали через сухой фильтр, со-
держащий безводный сульфат натрия, и упаривали
досуха при 40 °С. Полученный сухой остаток с помо-
щью нескольких капель хлороформа наносили в виде
полосы на стартовую линию пластин Sorbfil, покры-
тых силикагелем, размером 10×10 см и хроматогра-
фировали параллельно с раствором государствен-
ного стандартного образца юглон (Sigma-Aldrich) в
системе растворителей диэтиловый эфир – бензол –
муравьиная кислота (50:50:1) до продвижения фрон-
та растворителя на 5,74 см. В результате на хромато-
грамме (рисунок 1) наблюдали полосу (исследуемый
объект) и пятно (стандартный образец юглона), окра-
шенные в желтый цвет и имеющие одинаковые значе-
ния Rf (0,82).
Окрашенную полосу счищали и юглон элюиро-
вали этанолом, доводя объём элюата до 15 мл. По-
ловину полученного раствора разбавляли в 100 раз
этиловым спиртом и спектрофотометрировали в ди-
апазоне волн 200–400 нм спектральная кривая ис-
следуемого раствора полностью совпадает со спект-
ром этанольного раствора стандартного образца
юглона и имеет максимум поглощения при 248,9 нм
(рисунок 2).
Таким образом, из околоплодника ореха черного
по описанной методике выделен и идентифицирован
юглон.

Рисунок 1 Хроматограмма экстракта, полученного из около-
плодника ореха черного (Juglans nigra L.): 1, 1` – пятно стан-
дартного образца юглона, 2 – полоса нанесенного экстракта
Рисунок
2
Спектры
стандартного
образца
(1)
и
абсорб-
ции юглона, выделенного из околоплодника ореха черного
(Juglans nigra L.) (2)
Другую половину исследуемого раствора разбав-
ляли очищенной водой в 100 раз и подвергали микро-
биологическому анализу. В качестве тест-объектов бы-
ли выбраны музейные типичные представители (Г+) и
(Г–) бактерий – Staphуlococcus aureus (стафилококк зо-
лотистый) и Escherichia coli (кишечная палочка). Сте-
пень чувствительности тест-объектов к юглону опре-
делялась с помощью диффузного метода, основанного
на логарифмической зависимости размеров зон угне-
тения роста тест-микроорганизмов от концентрации
юглона.
Инокулят готовили из 18–20-часовой агаро-
вой культуры в мясо-пептонном бульоне, доводя
по мутности до 0,5 стандарта McFarland. Получен-
ную бульонную культуру разводили ещё в 10 раз сте-
рильным изотоническим раствором хлорида нат-
рия, что соответствовало конечной концентрации
(1–2) · 108 КОЕ/мл. Оптимальное количество посев-
ной дозы было выбрано таким, чтобы диаметр зон
угнетения для минимальной концентрации был не
менее 14 мм.
Для нанесения инокулята на чашки Петри с
плотной питательной средой использовали бактериологическую петлю. Петлю погружали в суспензию
микроорганизмов и инокуляцию на поверхность
агаровой среды проводили методом сплошного га-
зона, периодически поворачивая чашку Петри на
60°. Культуры (St. aureus и E. соli) инкубировались в
течение суток в термостате при 37 °С. Концентра-
ция активной фракции колебалась в зависимости
от эксперимента от 0,7 до 7,0%. В качестве объектов
сравнения использовали среду без активной фрак-
ции (плацебо). После нанесения тест-культур чашки
помещали в термостат и инкубировали 18–20 ч при
37 °С. По окончании инкубации проводили подсчет
задержки зоны роста. При измерении зоны ориенти-
ровались на полную ингибицию видимого роста. Ди-
аметры зон угнетения роста тест-микроорганизма
при помощи соответствующих приборов измеряли с
точностью до 0,1 мм.
Результаты микробиологической оценки свойств
тестовых микроорганизмов показали, что исследуе-
мые штаммы St. aureus и E. сoli, обладая типичными для
данных видов морфолого-культуральными и биохими-
ческими свойствами, проявили выраженную чувстви-
тельность к юглону.
Рисунок 3 Исследуемые штаммы St. aureus и E. сoli
Мы наблюдали зоны задержки роста золотис-
того стафилоккока и кишечной палочки вокруг
участков,
пропитанных
исследуемым
раствором
определенных концентраций, причем размеры зон
угнетения были больше по сравнению с контролем
(различия были статистически значимыми). Следу-
ет отметить, что юглон проявил выраженный эффект
в отношении обоих исследуемых видов микроорга-
низмов, однако кишечная палочка проявила боль-
шую чувствительность к юглону, чем золотистый
стафилококк. Нами найдено, что между размерами
зон угнетения роста микроорганизмов и концентра-
цией юглона имеется прямая зависимость. С этой
целью использовали спиртовый раствор юглона пос-
ле спектрофотометрического анализа, определен-
ные объёмы которого (0,5–3,0 мл) разбавляли в 100
раз очищенной водой и определяли антибиотичес-
кую активность по описанной выше методике. Для
Рисунок 4 Зависимость ДЗЗР St. аureus и E.coli от концентра-
ции юглона: V (мл) – объёмы основного раствора юглона, взя-
тые для разведения
примера на рисунке 4 приведен график зависимос-
ти диаметра зон задержки роста (ДЗЗР) St. аureus от
концентрации юглона.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований из око-
лоплодника ореха черного был выделен и идентифи-
цирован юглон. Показано, что юглон проявляет вы-
раженный бактериостатический эффект в отношении
Staphуlococcus aureus и Escherichia coli, что подтвержда-
ется литературными данными [2].

ЛИТЕРАТУРА
1
Ж.В. Дайронас, И.Н. Зилфикаров. Природные нафтохиноны:
перспективы медицинского применения. – Щелково. 2011
252 с.
2
Г.И.
Жунгиету,
Л.А.
Влад.
Юглон
и
родственные1,4-наф-
тохиноны. – Кишинев: Штиинца, 1978 94 с.
3
Ж.В. Дайронас, И.Н. Зилфикаров, А.В. Корочинский, В.В. Коро-
чинская. Определение нафтохинонов в сырье и препарате
ореха черного // Фармация. 2013 № 4 С. 12–14.
4
С.Г.
Полоник.
Противоопухолевая
и
иммуностимулирующая активность О- и S-ацетилгликозидов 5-гидрокси-1,4-
нафтохинона (юглона) // Химико-фармацевтический журнал.
2003 Т. 37 № 8 С. 3–4.
5
С.М. Ходжибаева, О.Ф. Филатова, А.А. Тыщенко. Новые аспекты
получения и контроля юглона // Химия природных соедине-
ний. 2000 № 3. С. 227–229.
6
С. Ashe. Antitumor quinones Mini Rev // Med. Chem. 2005 V. 5.
№ 5. P. 449–467.
7
R.H. Thomson. Naturally Occurring Quinones III. – London-New-
York: Chapman & Hall. 1987
8
J.S. Driscoll, G.F. Hazard, H.B. Wood, et all. Structure-Antitumor
Activity Relationships Among Quinone Derivatives // Cancer
Chemother. Repts. 1974 Part 2 V. 4 № 2 P. 1–35.
9
F. Pax. Grundzüge der Pflanzenverbreitung in den Karpaten // Die
Vegetation der Erde. Bd.2. – Leipzig. 1908 321 р.
10
J. Segura-Aguilar, К. Junsson, U. Tidifelt et al. The cytotoxic effects
of 5-OH-l,4-naphthoquinone and 5,8-diOH-l,4-naphthoquinone
on doxorubicin-resistant human leukemia cells (HK-60) // Leuk.
Res. 1992 V. 16 № 6–7. P. 631–637.


Из всех веществ, содержащихся в орехе, самую большую загадку представляет кристаллическое желто-оранжевое вещество —Юглон.


Это природный антибиотик, обладающий высокой бактерицидной активностью, впервые был выделен немецкими химиками Фогелем и Райшауэром в 1856 году из зеленой кожуры грецкого ореха; он также был обнаружен в листьях, корнях и стеблях орехового дерева.
Юглон обладает ярко выраженным аллелопатическим действием. Это значит, что он подавляет рост растений и может оказаться своего рода оружием ореха в «бактериологической войне» против других его зеленых соседи.
Есть сведения об использовании юглона в качестве косметического средства для предохранения кожи от ультрафиолетового излучения и радиации.
Исследования последних лет показали, что юглон — эффективный консервант для безалкогольных напитков.
В научной литературе вещество юглон известно как очень эффективное целебное средство, благодаря своим антибактериальным и антигрибковым свойствам. У юглона обширный спектр действия. Из 114 видов патогенных бактерий и грибков при тестировании юглон оказался беспомощным только против четырех. То есть это практически универсальное средство против массы болезней.
В медицине применяются все части грецкого ореха. Почки, листья, околоплодник и сок, вытекающий из ствола зеленого дерева, обладают фитонцидными свойствами и оказывают бактерицидное, то есть губительное для бактериальной флоры, действие. Летучие фракции фитонцидов свежих листьев и незрелого околоплодника грецкого ореха задерживают рост стафилококков, тифозной, дизентерийной, туберкулезной палочек, кандид и других грибков. Тканевые соки и водные вытяжки зеленых листьев и околоплодника грецкого ореха рекомендуются при лечении гнойных грибковых заболеваний кожи, трихомонадного кольпита. Препарат юглон, выделенный из околоплодника грецкого ореха и применяемый местно в виде мазей и растворов, оказывает хороший эффект при лечении стригущего лишая, экземы и других кожных заболеваний. Компрессы и впрыскивание зкстрактов, приготовленных из листьев ореха, уменьшают воспалительный процесс при туберкулезе лимфатических узлов, кожи, среднего уха и слизистой полости рта. При многих кожных заболеваниях местный лечебный эффект, оказываемый препаратами из зеленых листьев и околоплодника грецкого ореха, объясняется присутствием в них не только фитонцидов, но и дубильных веществ. Народная медицина рекомендует пить настой и отвары из листьев для улучшения обмена веществ и общего укрепления организма при истощении и уменьшении витамина С в организме, атеросклерозе сосудов головного мозга, а также при поносах. Экстракт из листьев грецкого ореха повышает свертываемость крови.

Из незрелых плодов грецкого ореха был получен концентрат в виде жидкости темно-коричневого цвета, обладающиий слабым вяжущим действием и ароматом листьев грецкого ореха. Состав концентрата Юглон содержал 1-2% витамина С, 1-3% тиамина, органические кислоты, железо, фосфор и др. Концентрат дает хороший эффект при лечении хронических расстройств пищеварения, улучшает обмен веществ и обладает общеукрепляющим действием. Кроме витамина С в листьях и околоплоднике содержатся витамины В1, Р, каротин, ядра орехов богаты витаминами Е, В1, B6, фолацином.

Витамин С нормализует проницаемость стенок сосудов, повышает реактивность организма к инфекциям, улучшает функцию печени и почек, участвует в окислительно-восстановительных процессах.
Витамин Р совместно с витамином С нормализует проницаемость капилляров.
Фолацин улучшает кроветворение, белковый обмен.
Витамин В1 регулирует функцию нервной истемы, органов кровообращения и пищеварения, повышает сопротивляемость организма к инфекциям.
Витамин В6 улучшает функцию печени, синтез гемоглобина.
Каротин усиливает процессы роста, повышает устойчивость организма к инфекциям, нормализует зрение.
Витамин Е нормализует функцию половых желез, улучшает работу сердечной мышцы; при его недостаточности увеличивается проницаемость и ломкость капилляров.
Зеленые орехи— эффективное средство при желудочных коликах, диспепсии. В современной отечественной и зарубежной медицине широко испольэуют листья, собранные весной и в начале лета, а также околоплодники недозрелых плодов, заготавливаемых в августе. Химические испытания оказали, что водный экстракт из листьев и околоплодников оказывает терапевтический эффект при некоторых формах туберкулеза кожи, гортани, туберкулезном лимфадените. До недавнего времени из околоплодников получали препараты карнон и юглон, применявшиеся при туберкулезе кожи, стригущем лишае, экземе, аллергии, стрептококковых и стафилококковых заболеваниях кожи и других кожных болезнях. Юглон обладает бактерицидным действием.

В народной медицине листья и околоплодники издавна применяли при цинге, катаре кишечника и поносе, зубной боли, ревматизме, подагре, некоторых гинекологическнх болезнях, болезнях почек, сердца и мочевого пузыря, как потогонное, ранозаживляющее и противовоспалительное для лечения ран, язв, фурункулов, при обморожении, стоматите, ангине, как антигельминтное против круглых глистов, при кровотечениях геморроидальных, язвенных, из десен, при атеросклерозе, сахарном диабете (снижает процент сахара в моче), как общеукрепляющее средство при авитаминозах, при угревой сыпи и других кожных болезнях и нарушениях обмена веществ — аллергии, рахите, экссудативном диатезе, воспалении лимфатических узлов.